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更新时间：2022-11-09 | 阅读：1272
详情介绍
古典猪瘟病毒通用型试剂盒(实时荧光PCR法)
【产品名称】
通用名称： 古典猪瘟病毒通用型试剂盒(实时荧光PCR法)
【包装规格】 25T/盒 & 50T/盒
【预期用途】
本试剂盒适用于古典猪瘟病毒检测，可用于临床古典猪瘟病毒感染的辅助诊断，但不作确诊使用。
【检验原理】
古典猪瘟病毒通用型试剂盒(实时荧光PCR法)
本试剂盒针对古典猪瘟病毒的高度保守区域设计特异性引物和探针，在反应体系中含古典猪瘟病毒基因组模板的情况下，PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用荧光定量PCR仪对PCR过程中相应通道信号进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。
【主要组成成份】
序号 | 组成 | 25T/盒 | 50T/盒 |
1 | CSFV RT-PCR反应液 | 375 μL×1管 | 750 μL×1管 |
2 | CSFV逆转录酶 | 50 μL×1管 | 100 μL×1管 |
3 | CSFV Taq酶 | 75 μL×1管 | 150 μL×1管 |
4 | CSFV阳性对照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
5 | CSFV阴性对照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
6 | 说明书 | 1份 | 1份 |
注：阴性对照为猪基因组DNA，阳性对照为失去活性的古典猪瘟病毒cDNA。
【储存条件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反复冻融，有效期12个月。
【适用仪器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道实时荧光定量PCR仪。
【样本要求】
1.血液或血清样品：使用无菌注射液抽取样品置于离心管中待检。
2.肌肉或内脏样品：取少量样品（2～3克）于研钵或匀浆器中研磨，然后将研磨匀浆转入无菌离心管中，3000rpm/min 离心10分钟取上清待检。
3.应避免标本间交叉污染。
4.标本收集后可立即检测；若不能立即检测，可置于2～8℃冷藏过夜保存；如需长期保存，标本应冻存于-80℃以下，避免反复冻融。
【检验方法】
1. 试剂准备（试剂准备区）
（1）从冰箱中取出试剂盒, 从试剂盒中取出实验所需试剂,充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体。
（2）核算当次实验所需要的反应数（n），并根据如下表所示反应体系计算当次实验所需要的各种试剂量。
n =阴性对照数（1T）+阳性对照数（1T）+误差预留量（1T）+样本数
单反液配制表(每份) | RT-PCR反应液 | 15.0 μL |
逆转录酶 | 2.0 μL | |
Taq酶 | 3.0 μL |
(3)在无菌离心管中加入上述试剂，充分混匀后瞬时离心。按照20 μL/管分装量将试剂分装至PCR反应管。
2.样本准备（样本处理区）
用QIAGEN、Roche公司RNA提取试剂盒提取RNA，具体操作按照其试剂盒说明书操作。
3.加样
在上述制备好的PCR反应样本管中分别加入处理好的待测标本RNA各5 μl、终体积25 μl/管，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到PCR仪器上。阴性对照和阳性对照管则各加5 μL试剂盒自带的阴性对照或阳性对照品，终体积为25 μl/管，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到PCR仪器上。
4. PCR（PCR扩增区）
（1）取样本处理区准备好的PCR反应管，放置在实时荧光定量PCR仪样品槽相应位置，并记录放置顺序。
（2）按下表设置仪器核酸扩增相关参数进行PCR扩增。
反应体积 | 25 μL | 通道选择 | FAM通道采集古典猪瘟病毒荧光信号 |
PCR 反应 条件 | 步骤 | 条件 | 循环数 |
反转录 | 42℃：10分钟（min） | 1 | |
预变性 | 95℃：3分钟（min） | 1 | |
预扩增 | 95℃：5秒（s） | 5 | |
55℃：40秒（s） | |||
PCR扩增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
55℃：40秒（s） （此阶段结束时采集荧光信号） |
注：ABI系列荧光PCR仪在设置时不选ROX校正，设置淬灭基团选择None。
【参考值（参考范围）】
1.试剂盒有效性判定：
（1）阳性对照：有典型S型扩增曲线或Ct值≤35。
（2）阴性对照：Ct值＞38或无Ct值，线形为直线或轻微斜线，无指数增长期。
2.标本结果判定：
（1）阳性：标本检测结果Ct值≤35或有明显指数增长期。
（2）可疑：标本检测结果Ct值在35～38范围内。此时应对标本进行重复检测，如重复实验结果Ct值仍在35～38范围内，有明显指数增长期，则判定为阳性，否则为阴性。
（3）阴性：标本检测结果Ct值＞38或无Ct值。
【检验结果的解释】
通道及检测结果 | 标本检测结果解释 |
FAM | |
阳性（＋） | 标本中检出古典猪瘟病毒RNA |
阴性（－） | 标本中未检出古典猪瘟病毒RNA |
【检验方法的局限性】
当检测样本中被检核酸浓度低于本试剂盒的低检出*可能会发生假阴性的结果。
被检样本在采集、运输、储存以及处理过程中操作方式不当容易造成RNA降解而产生假阴性结果。
样本在采集、运输、储存以及处理过程中发生交叉污染，则容易得到假阳性结果。
【产品性能指标】 产品的低检出限为102 Copies/mL，产品CV值≤5%。
【注意事项】
整个检测过程应严格按照本说明书要求分别在试剂准备区、样本处理区和PCR扩增区进行操作，各区实验服、仪器、耗材应独立使用，不能混用；实验用吸头采用带滤芯吸头；样本处理区应配有生物安全柜，样本处理在生物安全柜中进行操作；三个区应该配有紫外线杀菌装置。
为避免RNA降解，样本处理过程应在0-4℃条件下操作，且完成实验后立即上机检测；样本处理过程中使用的器具耗材应经过无核酶处理。
每次实验应该设置阴、阳性对照。
试剂盒所有试剂在使用前应该在常温下充分融化混匀，并应瞬时离心。
试剂盒内所配阴性和阳性对照在次使用前应全部转移至标本准备区，并单独存放。
为防止荧光干扰，应避免裸手直接接触PCR反应管，并应避免在PCR反应管上进行任何标记。
仪器扩增相关参数应按照本说明书相关要求进行设置；不同批号试剂不能混用。
ABI系列荧光定量PCR仪参数设置中不选ROX校正，淬灭基因选择None。
实验过程中产品的废弃物应该进行无害化处理后方可丢弃。
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