禽流.感病毒H5亚型检测试剂盒（PCR法）

【产品概述】

禽流.感病毒H5亚型属于高致病性禽.流感病毒，对禽类危害巨大,甚至会感染人类，如H5N1禽.流感为卫生部传染病防治法中的法定传染病，属人感染高致病性禽.流感。

 禽流.感病毒H5亚型检测试剂盒（PCR法）应用RT-PCR荧光探针法，快速、准确地定性检测具流感症状的人群或禽类动物的唾液或分泌物等样本中的H5亚型禽.流感病毒核酸，适用于该亚型病毒的检测、辅助诊断和流行病学调查等。

【试剂盒组成】

【储存条件及有效期】

-20℃避光保存，避免反复冻融，有效期6个月。

【禽流.感病毒H5亚型核酸荧光PCR检测试剂盒适用仪器】

ABI7300、ABI7500、LightCycler 480、iCycleriQ5、CFX96、SLAN等荧光定量PCR仪。

【样本采集、存放及运输】

u 样本采集：各类型样本按照常规方法采集；

u 存放：样本在2~8℃条件下保存应不超过72h，-70℃以下可长期保存，但应避免反复冻融（多冻融3次）；

u 运输：采用冰盒加冰密封进行运输。

【自备试剂】

核酸提.取试剂，如QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini试剂盒，也可选择其他合适的核酸提取产品。

【   禽流.感病毒H5亚型检测试剂盒（PCR法）使用方法】

注：所有试剂使用前需*解冻，混合均匀，6,000rpm离心数秒后使用。

1. 样本处理（样本处理区）

待检样本的核酸提取可采用病毒RNA提取试剂盒或自动化核酸提取仪等，具体提取方法请参照相关说明书；阳性质控品及阴性质控品无需提取，可直接使用。

2. 扩增试剂准备（PCR前准备区）

取N个（N=阴性质控品+待检样本+阳性质控品）PCR反应管，每管分别加入H5 RT-PCR反应液19 μl、RT-PCR酶1 μl (也可根据每人份用量计算N+1份H5 RT-PCR反应液、RT-PCR酶所需总量，两者混匀离心后分装20 μl至单个PCR反应管)

将所有PCR反应管于6,000rpm离心30s，转移至样本处理区。

      3. 加样（样本处理区）

在上述的PCR反应管中分别加入待检样本RNA提取物、阴性质控品和阳性质控品各5 μl，盖紧管盖，于6,000rpm离心10s，转移至扩增区。

   * 注意事项：建议加样顺序是阴性质控品、待检样本、阳性质控品。

      4. PCR扩增（扩增区）

1)      仪器设置（以ABI Prism 7500为例）

   将PCR反应管放入PCR仪内，按照对应顺序设置阴性质控品(NTC)、阳性质控品(Standard)及待检样本(Unknown)。Reporter Dye为FAM，Quencher Dye为None，参比染料(Passive Reference)为 None。

1)      扩增程序

50℃ 10min

95℃ 3min

        95℃ 10sec

60℃ 1min

60℃采集荧光信号，反应体系为25 μl。

禽流.感病毒H5亚型检测试剂盒（PCR法）结果分析条件设定

u 基线（Baseline）设定：应选择该次实验指数扩增前所有样本荧光信号比较稳定的一段区域（所有样本荧光信号无较大波动），起始点（Start）应避开荧光采集起始阶段的信号波动，终止点（End）应比早出现指数扩增的样本Ct值减少1~3个循环，建议基线设为6~15。

u 阈值(Threshold)设定：将阈值线设定在刚好超过正常阴性质控品扩增曲线的*点。

【质控标准】

1.   阴性质控品的检测结果应为阴性，无指数扩增期，Ct=40或无Ct；

2.   阳性质控品的检测结果应为阳性，有明显的指数扩增期，Ct值应小于等于35；

3.   以上要求需在一次实验中同时满足，否则该次实验视为无效。

【   禽流.感病毒H5亚型检测试剂盒（PCR法）结果判断】

1.   阳性：有明显的指数扩增期，且Ct＜38；

2.   可疑：有明显的指数扩增期，且38≤Ct<40，此时样本为可疑样本；对于可疑样本建议复核一次，若复核结果Ct<40且有指数扩增期，则判定为阳性，否则判定为阴性；

3.   阴性：无指数扩增期，Ct=40或无Ct值均判定为阴性样本。

【对检验结果的解释】

1.   实验室环境污染、试剂污染、样品交叉污染会出现假阳性结果；

2.   试剂运输、保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，可能会导致出现假阴性结果。

【   禽流.感病毒H5亚型检测试剂盒（PCR法）使用注意事项】

1.   有关实验室管理规范请严格按照行业行政主管部门颁布的有关基因扩增检验实验室的管理规范执行。

2.   本试剂盒仅用于体外检测。

3.   实验请严格分区操作：

第1区：PCR前准备区 — 准备扩增所需试剂；

第二区：样本处理区 — 待测样本和对照品处理；

第三区：检测区 — PCR扩增检测。

4.   各区物品均为，不得交叉使用，避免污染，实验后即请清洁工作台；

5.   试剂盒内各试剂使用前，充分融化后请稍事离心。

6.   在－20℃保存的样本裂解产物，应在加样前置室温解冻，作短暂离心后使用。

7.   分装有反应液的检测板或装入密实袋内再转移至样本区。

8.   加样时应使样品*落入反应液中，不应有样品粘附于管壁上，加样后应尽快封上封板膜。

9.   扩增完毕立即取出检测板，密封在塑料袋内，丢弃于地点。

10.   反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。

11.   实验中用过的吸头请直接打入盛有1%次氯酸钠的废物缸内，并与其他废弃物品一同灭菌后丢弃。

12.   工作台及各物品定期用1%次氯酸钠、75%酒精或紫外灯进行消毒。

13.   建议使用离心管和吸头一览表