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更新时间：2022-09-27 | 阅读：1146
详情介绍
禽.流感病毒H7N9亚型检测试剂盒（双色实时荧光PCR法）
【包装规格】 25头份/盒 & 50头份/盒
【预期用途】
禽流.感病毒H7N9亚型检测试剂盒（双色实时荧光PCR法）利用实时荧光PCR原理，定性检测禽.流感病毒H7N9亚型（AIV-H7N9），对AIV-H7N9引起的禽.流感的诊断和监控具有重要指导意义。
【检验原理】
禽流.感病毒H7N9亚型检测试剂盒（双色实时荧光PCR法）针对AIV-H7N9高度保守区域设计特异性引物和探针，在反应体系中含AIV-H7N9基因组模板的情况下，PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。
注：阴性对照为禽类基因组DNA，阳性对照为失去活性的AIV-H7N9病毒cDNA。
【储存条件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反复冻融,有效期12个月。
【适用仪器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道实时荧光定量PCR仪。
【样本要求】
1.样品取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下：
咽喉拭子，采取时要将拭子深入喉头及上颚裂来回刮3次～5次，取咽喉分泌液；将咽喉拭子放人盛有1.0mL生理盐水的离心管中备用，应避免标本间交叉污染。
2.标本收集后可立即检测；若不能立即检测，可置于2～8℃冷藏过 夜保存；如需长期保存，标本应冻存于-80℃，避免反复冻融。
【检验方法】
1. 试剂准备（试剂准备区）
（1）从冰箱中取出试剂盒, 从试剂盒中取出实验所需试剂,充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体。
（2）核算当次实验所需要的反应数（n），并根据如下表所示反应体系计算当次实验所需要的各种试剂量。
n =阴性对照数（1T）+阳性对照数（1T）+误差预留量（1T）+样本数
单反液配制表(每头份) | RT-PCR反应液 | 15.0 μL |
逆转录酶 | 2.0 μL | |
Taq酶 | 3.0 μL |
（3）在无菌离心管中加入上述试剂，充分混匀后瞬时离心。按照20 μL/管分装量将试剂分装至PCR反应管。
2.样本准备（样本处理区）
用QIAGEN、Roche公司RNA提取试剂盒提取RNA，具体操作按照其试剂盒说明书操作。
3.加样
在上述制备好的PCR反应管中分别加入处理好的待测标本RNA各5 μl、终体积25 μl/管，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到PCR仪器上。
根据需要，在上述准备好的PCR反应管中分别加入阴性对照品以及阳性对照品各5 μl，终体积为25 μl/管，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到PCR仪器上。
4. PCR（PCR扩增区）
（1）取样本处理区准备好的PCR反应管，放置在实时荧光定量PCR仪样品槽相应位置，并记录放置顺序。
（2）按下表设置仪器核酸扩增相关参数进行PCR扩增。
反应体积 | 25 μL | 通道选择 | FAM通道采集 AIV-H7荧光信号 HEX通道采集 AIV-N9荧光信号 |
PCR 反应 条件 | 步骤 | 条件 | 循环数 |
反转录 | 42℃：10分钟（min） | 1 | |
预变性 | 95℃：3分钟（min） | 1 | |
预扩增 | 95℃：5秒（s） | 5 | |
55℃：40秒（s） | |||
PCR扩增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
55℃：40秒（s） （此阶段结束时采集荧光信号） |
注：ABI系列荧光PCR仪在设置时不选ROX校正，设置淬灭基团选择None
【参考值（参考范围）】
1.试剂盒有效性判定：
（1）阳性对照：有典型S型扩增曲线或Ct值≤35。
（2）阴性对照：Ct值＞38或无Ct值，线形为直线或轻微斜线，无指数增长期。
2.标本结果判定：
（1）阳性：标本检测结果Ct值≤35或有明显指数增长期。
（2）可疑：标本检测结果Ct值在35～38范围内。此时应对标本进行重复检测，如重复实验结果Ct值仍在35～38范围内，有明显指数增长期，则判定为阳性，否则为阴性。
（3）阴性：标本检测结果Ct值＞38或无Ct值。
【检验结果的解释】
通道及检测结果 | 标本检测结果解释 | |
FAM | HEX | |
+ | + | 样本中检测出AIV-H7和AIV-N9 |
+ | - | 样本中检测出AIV-H7，未检测出AIV-N9 |
- | + | 检测出AIV-N9，未检测出AIV-H7。 |
- | - | 未检测出AIV-H7和AIV-N9。 |
【检验方法的局限性】
1. 当检测样本中被检核酸浓度低于本试剂盒的*检出*可能会发生假阴性的结果。
2. 被检样本在采集、运输、储存以及处理过程中操作方式不当容易造成RNA降解而产生假阴性结果。
3. 样本在采集、运输、储存以及处理过程中发生交叉污染，则容易得到假阳性结果。
【产品性能指标】 产品的*检出限为102 Copies/mL，产品CV值≤5%。
【注意事项】
1. 整个检测过程应严格按照本说明书要求分别在试剂准备区、样本处理区和PCR扩增区进行操作，各区实验服、仪器、耗材应独立使用，不能混用；实验用吸头采用带滤芯吸头；样本处理区应配有生物安全柜，样本处理在生物安全柜中进行操作；三个区应该配有紫外线杀菌装置。
2. 为避免RNA降解，样本处理过程应在0-4℃条件下操作，且完成实验后立即上机检测；样本处理过程中使用的器具耗材应经过无核酶处理。
3. 每次实验应该设置阴、阳性对照。
4. 试剂盒所有试剂在使用前应该在常温下充分融化混匀，并应瞬时离心。
5. 试剂盒内所配阴性和阳性对照在第1次使用前应全部转移至标本准备区，并单独存放。
6. 为防止荧光干扰，应避免裸手直接接触PCR反应管，并应避免在PCR反应管上进行任何标记。
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